IPS诱导肠类器官培养可分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中/后肠模式化诱导、类器官培养。本文将重点讲述第二阶段，即内胚层分化与中/后肠模式化诱导。

一、前期准备

1. 试剂与设备

• 细胞：H1/H9 hESC或患者来源的iPSCs。
• 基础培养基：人多能干细胞培养基（abs9403）、RPMI1640（abs9484）。
• 消化液：人多能干细胞消化液（abs9409）。
• 培养基添加剂：L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液（2mM，abs9295）、双抗（abs9244）。
• 生长因子：Activin A（100ng/mL，abs05801）、FGF4（500ng/mL，abs06269）、WNT3a（500ng/mL，abs05632）。
• 基质胶：即用型基质胶（培养板包被，abs9410）、类器官专用基质胶（abs9495）。
• 血清：透析胎牛血清（abs945）。
• 关键设备：表面培养皿、立体显微镜、无菌手术刀、预冷微量离心管。

2. 试剂配制

• 内胚层分化培养基：
  • Day 1：RPMI1640 + L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液（2mM） + 双抗（1%） + Activin A（100ng/mL）。
  • Day 2：Day 1配方 + 透析胎牛血清（0.2%）。
  • Day 3：Day 1配方 + 透析胎牛血清（2%）。
• 中/后肠分化培养基：RPMI1640 + 透析胎牛血清（2%） + FGF4（500ng/mL） + WNT3a（500ng/mL）。

二、hPSCs传代与铺板

1. 细胞传代（耗时2小时）

使用人多能干细胞消化液消化hPSCs至边缘卷起。用细胞刮刀轻柔剥离细胞团，反复吹打至1-2mm大小的细胞团。按1:6比例接种至Matrigel包被的24孔板（每孔约5000个细胞团）。轻敲培养板以使细胞均匀分布，37°C过夜培养。

2. 细胞扩增至85-90%融合（3-4天）

每日更换人多能干细胞培养基，观察细胞密度。注意，当细胞密度过高时可能导致自发分化，过低则分化效率降低，这时需重新铺板。

三、内胚层分化（3天）

1. Day 1：吸除人多能干细胞培养基，加入无血清的Day 1内胚层培养基，培养24小时。
2. Day 2：更换为含0.2%透析胎牛血清的Day 2内胚层培养基，培养24小时。
3. Day 3：更换为含2%透析胎牛血清的Day 3内胚层培养基，培养24小时。
4. 可选：验证分化效率，采用免疫染色检测FOXA2/SOX17双阳性细胞，效率应达到85-90%。

四、中/后肠模式化（3-4天）

1. 诱导球状体形成

吸除内胚层培养基，加入中/后肠分化培养基，并每日更换。48小时后，立体显微镜下观察上皮增厚，72-96小时间球状体(spheroids)从单层细胞脱离。

2. 收集球状体

使用200μL枪头收集游离球状体，每管约50个，置于冰上备用。

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