本方法适用于总长度（载体 + 所有片段）不超过20kb的重组实验。在设计目的片段引物和进行PCR扩增时，建议使用高保真酶，并且摸索最佳的退火温度，以优化反应体系和程序。
1. 双酶切：选择两种限制性内切酶同时对载体质粒进行线性化处理。内切酶的选择可以参考第二章第一节内容；
2. 目的片段和线性化载体的纯化回收：推荐采用切胶回收的方式纯化（切胶时间最好控制在3分钟以内，以避免紫外线照射对DNA的损伤），并使用NanoDrop或OneDrop等仪器检测回收浓度，浓度应当≥20ng/μl。同时，需跑胶鉴定是否为单一目的条带；
3. 当回收浓度较低时，可以通过增加PCR/酶切反应体系，采用多管反应、单管回收的方式，以提高回收产物的浓度。
1. 连接反应体系按说明书要求计算投入量，各组分的投入体积应≥1μl，如浓度过高可以稀释；
2. 感受态转化涂板：推荐使用DH5α、Fast-T1等克隆用化学感受态细胞；感受态细胞不可反复冻融，-80°C取出后建议一次性使用；
3. 重组产物体积与感受态细胞体积的比例为1:10，建议将10μl重组产物加入至100μl感受态细胞中，或将5μl重组产物加入至50μl感受态细胞中；
4. 热激时间需按照感受态细胞说明书操作；
5. 平板抗生素抗性应与转化载体抗性一致；
6. 对菌液涂板体积：将菌液离心（2500×g、3分钟），移液管吸取丢弃多余的LB培养基，保留100μl重悬后全部涂板，或吸取适量涂板。
1. 从平板中挑取适中大小的单克隆菌落，避免选择过大或过小的菌落；
2. 挑取多个单克隆菌落进行鉴定分析；
3. 将挑取的菌落放入已添加10μl ddH2O的15ml或2ml EP管中溶解均匀，取1-2μl作为PCR反应的模板（10/20μl体系）；
4. 推荐使用一对分别位于片段与载体的上下游引物进行PCR鉴定。
1. 克隆不成功：可能由于引物同源臂设计错误，长度（不计算酶切位点）应为15-20bp之间，过长或过短都会影响重组效率；GC含量应保持在40-60%之间，超出范围同样会影响效率。建议使用CEDesign在线设计工具；
2. 重组反应体系不符合要求：片段和线性化载体的总长度不应超过20kb，最好进行切胶回收并确保回收浓度不低于20ng/μl；浓度过高时需进行稀释，确保体系投入体积不小于1μl；投入量应根据相关公式计算；
3. 连接反应不适当：应在PCR仪中进行，设置温度和时间应遵循说明书指导；若同源臂GC含量超过60%或连接片段数量较多的情况下，连接时间可延长至30分钟。此外，C112/C113的温度和时间可调整为50°C、15分钟；
4. 阳性对照反应：使用试剂盒中提供的线性化载体和插入片段，按说明书配制重组反应体系，以排除其他实验材料及操作因素的影响；
5. 转化涂板操作不当：应选择DH5α、Fast-T1等克隆用化学感受态细胞，而非电击感受态细胞；重组产物与感受态体积的比例应为1:10；热激时间应遵循感受态细胞说明书操作；涂板前需将菌液离心（2500×g、3分钟），丢弃多余的LB培养基，保留100μl并全部涂板。
此方法为生物医药领域的重组实验提供了一套有效的指导方案，确保实验步骤清晰规范。对于使用尊龙凯时的科研人员而言，掌握此技术能够有效提升实验成功率与重组效率。
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