细胞凋亡，又称程序性细胞死亡，是维持机体稳定、清除异常或多余细胞的关键生理过程。在生物医学研究中，对凋亡细胞的准确检测和定量至关重要。流式细胞术凭借其高通量、多参数、定量的优势，成为检测细胞凋亡的金标准方法。其中最经典且常用的技术是AnnexinV结合/碘化丙啶（PI）双染法。

核心原理

AnnexinV：用于识别早期凋亡细胞。在细胞凋亡的早期，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）会翻转到外侧，这是细胞发出“吃我”信号的关键。AnnexinV是一种钙离子依赖的磷脂结合蛋白，对PS具有高亲和力，可特异性结合暴露在细胞膜外侧的PS，从而标记早期凋亡细胞。

碘化丙啶（PI）：用于识别晚期凋亡和坏死细胞。PI是一种核酸染料，无法穿透完整的细胞膜。只有在细胞膜完整性丧失时（如晚期凋亡或坏死），PI才能进入细胞，与DNA/RNA结合并发出荧光。正常活细胞和早期凋亡细胞因膜完整而拒染PI。通过同时检测AnnexinV和PI的信号，能够将细胞分为四类：

• AnnexinV⁻/PI⁺：坏死细胞（膜完整性丧失，但PS未外翻或已降解）
• AnnexinV⁺/PI⁺：晚期凋亡细胞（膜PS外翻，膜完整性丧失）
• AnnexinV⁻/PI⁻：活细胞（正常/未凋亡）
• AnnexinV⁺/PI⁻：早期凋亡细胞（膜PS外翻，膜完整）

实验步骤

以贴壁细胞为例，进行AnnexinV/PI双染法。所需的试剂与耗材包括：

• 细胞样本（处理组和对照组）
• 1x AnnexinV结合缓冲液（如10mM HEPES, 140mM NaCl, 25mM CaCl₂, pH 7.4）
• FITC（或其他荧光素）标记的AnnexinV
• 碘化丙啶（PI）溶液（工作浓度通常为1-5μg/mL）
• PBS（无钙镁）
• 胰酶（不含EDTA或含低浓度EDTA）或温和细胞刮刀
• 流式管与离心机
• 冰与移液器及枪头

细胞准备与处理

将细胞接种于培养板中，生长至合适密度，施加凋亡诱导因素（如药物、射线或饥饿等）。注意根据实验目的优化处理时间（通常几小时至几十小时），以获得适当的凋亡比例。在处理时间结束时，确保收集足够数量的细胞（通常≥1×10⁶个/样本）。

细胞收集

贴壁细胞的处理过程：

• 轻柔地吸弃培养液，避免直接冲击细胞。
• 用预冷的PBS轻洗细胞1-2次。
• 方法一（推荐）：添加适量的无EDTA或低浓度EDTA的胰酶消化，时间控制在30秒至1分钟，待细胞刚刚开始变圆松动时，立即加入含血清的培养基终止消化并轻柔吹打以收集细胞。
• 方法二：洗涤后直接用预冷的细胞刮刀轻刮下细胞，收集到离心管中。

洗涤与重悬

用预冷的PBS重悬细胞，离心300g 5分钟并弃去上清，重复一次以去除残留培养基和血清。然后用1x AnnexinV结合缓冲液重悬细胞沉淀，制备成单细胞悬液，避免剧烈吹打生成气泡，并转移到流式管中。

染色与检测

根据试剂说明书用FITC-AnnexinV进行染色，轻柔混匀后在冰上避光孵育10-15分钟。接着在孵育结束前5分钟或结束时加入PI溶液以完成双染。流式检测应在染色完成后1小时内完成，避免影响结果准确性。

结果解读

流式细胞仪分析软件（如FlowJo等）会生成双参数散点图，X轴为AnnexinV荧光强度，Y轴为PI荧光强度，依据象限划分细胞类别。通过这些数据，可以有效判断细胞的凋亡状态，对研究结果进行分析。

注意事项与优化技巧

在进行细胞凋亡检测时，样本新鲜度至关重要，务必在处理后尽快检测（<1小时）。轻柔操作所有步骤以避免机械损伤。此外，使用的不含EDTA或低浓度EDTA的胰酶，并严格控制消化时间，以保证数据的准确性。

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