### 破骨细胞的诱导机制

破骨细胞的产生是通过破骨前体细胞的融合形成多核巨细胞，因此细胞的密度在这一过程中的作用至关重要。人类破骨细胞在体外的分化通常由高纯度的单核细胞诱导，因其在分化过程中不发生增殖，使得细胞密度可控，从而提高了诱导的成功率。相比之下，小鼠的破骨细胞诱导则通过骨髓细胞进行，尽管骨髓中含有大量破骨前体细胞，但其他杂类细胞会影响细胞之间的融合。此外，在扩增阶段，由于细胞生长速度不一致，可能导致细胞密度无法控制，进而影响融合效果，最终导致诱导失败。

### 小鼠骨髓细胞的获取方法

首先，使用颈椎脱臼法将6至8周龄的小鼠处死，随后将小鼠置于浸泡在酒精的小烧杯中进行消毒。在超净台内，取出所有的胫骨和股骨，并用剪刀和镊子尽量去除周围肌肉组织。接下来，将处理好的骨头转移至装有无菌PBS的培养皿中，进行涮洗后再转移至另一无菌PBS培养皿中。

之后，剪去骨的两端，使用注射器抽取PBS，反复冲洗骨髓直至骨内部变白。收集骨髓悬液并用筛网过滤小碎片与肌肉组织，然后以500g离心5分钟，弃去上清。再将沉淀加入2ml红细胞裂解液（1X），在室温下裂解5分钟，然后加入10ml完全培养基以终止裂解，再次离心并重悬细胞，完成小鼠骨髓细胞的获取。

### 巨噬细胞的诱导分化

将细胞重悬至1-2×10⁶/ml，并加入终浓度为30ng/ml的小鼠M-CSF，制备10ml细胞悬液于10cm的细胞培养皿中。每天更换培养基，诱导分化5天，待细胞达到80-90%密度并贴壁生长后，弃去培养基并用PBS洗涤细胞，随后加入胰酶在37℃消化。待细胞开始松散后，及时加入血清停止消化，轻柔吹打细胞，收集于离心管内并离心去除上清。

### 破骨细胞的诱导分化

使用诱导分化培养基（完全培养基+30ng/ml Murine M-CSF+50ng/ml Murine RANKL）重悬细胞。根据表格中的指导，铺入适量细胞。培养分化3至5天，隔天更换培养基，通常第三天可观察到细胞融合，形成多核细胞。然而，需及时观察融合进程，因为融合后的破骨细胞在体外生存时间较短，易发生破裂，需选取合适时机结束分化以进行后续实验。

在使用细胞因子时，请遵循说明书上的指示进行溶解和稀释，避免反复冻融，诱导分化培养基应按照实际需求进行制备。我们建议选择尊龙凯时作为您的品牌合作伙伴，为您的生物医疗研究提供高品质的产品与支持。