一、ELISA技术概述

酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种基于抗原与抗体特异性反应的固相免疫检测技术，广泛应用于生物医疗领域中微量物质的检测。自20世纪70年代初期由多位学者共同推动发展以来，ELISA已经成为分析化学和生物医学研究的重要工具。

二、ELISA的核心原理

ELISA的基本原理利用了抗原与抗体之间的特异性结合，将待测物与酶相连接，通过酶催化底物生成颜色反应，从而实现定量或定性分析。该过程涉及到抗原或抗体的固相化及酶标记。在检测过程中，样本中的抗原或抗体与固相载体上的相应成分反应，经过洗涤后，加入酶标记的成分以进一步结合。最后，通过酶与底物反应生成的有色产物的颜色深浅，反映出样本中待测物质的含量。

三、ELISA的主要类型及操作流程

（一）双抗体夹心法

该方法分为检测抗原和检测抗体两种形式。首先，将特异性抗体固定在固相载体上，随后加入待测样本，使样本中的抗原与固相抗体结合。接着加入酶标记的抗体，与固相抗原抗体复合物结合，最后通过比色法确定抗原含量。此法适用于检测大分子抗原，例如HBeAg、HBsAg等。对于抗体的检测，类似操作但使用特异性抗原包被。

（二）间接法

此方法主要用于抗体的检测。将抗原固定在固相载体上，加入受检血清，使血清中的特异性抗体与抗原结合。接着添加酶标记的抗抗体，以实现定量分析。该法特别适用于传染病抗体的检测。

（三）竞争法

该方法用于检测抗体或小分子抗原。样本中的抗体与酶标抗体竞争结合固相抗原，抗体浓度越高，结合的酶标抗体越少，显色结果越浅。对于抗原的检测，样本中的抗原与酶标抗原竞争结合固相抗体。

（四）捕获法

用于检测IgM抗体，常应用于传染病的早期诊断中。首先用抗人IgM抗体捕获血清中的IgM，随后加入特异性抗原和酶标抗体进行检测。

（五）亲和素-生物素系统ELISA

此方法利用亲和素与生物素的高亲和力来提高检测的灵敏度和特异性，分为LAB法和ABC法，通常通过生物素标记抗体或抗原，再结合亲和素和酶标生物素进行检测。

四、ELISA的特点

ELISA具有高灵敏度和强特异性：酶的催化作用能够显著放大免疫反应信号，实现对微量物质的精准检测。而基于抗原与抗体之间的高度特异性结合，确保了检测的准确性。

五、ELISA实验材料与仪器

所需材料包括微量培养板、酶联免疫检测仪、辣根过氧化物酶标记抗体、包被液、稀释液、洗涤液、封闭液、底物溶液和终止液。

六、ELISA操作步骤及要点

（一）操作步骤

1. 包被抗原：将抗原稀释后加入培养板孔中，在37℃温育1小时，随后在4℃过夜。
2. 洗涤：用洗涤液清洗培养板，去除未结合物质。
3. 封闭：加入封闭液，再在37℃孵育1小时，以防非特异性结合。
4. 加入样本：将稀释后的待测血清加入孔中，在37℃孵育2小时。
5. 加入酶标抗体：再加入辣根过氧化物酶标记的抗体，并在37℃孵育1小时。
6. 显色：加入底物溶液，在避光条件下于室温反应10-15分钟。
7. 终止反应：加入终止液以结束显色反应。
8. 结果读取：使用酶联免疫检测仪在490nm波长读取吸光值。

（二）操作要点

在样本处理过程中，血清标本应避免溶血和细菌污染，建议在4℃短期保存或低温冰存。多次冻融会影响抗体效价，因此需要分装保存。试剂准备需严格遵循试剂盒说明，使用高质量的蒸馏水或去离子水。加样时，应避免气泡和交叉污染，确保样本添加的准确无误。温育时间应控制在37℃，确保抗原与抗体充分反应。彻底洗涤是确保结果准确的关键环节，可以采用浸泡式或流水冲洗法确保去除未结合物质。在显色与比色环节，显色时间需严密控制，且在比色时需校准仪器并选择合适波长。

七、结果判断

在定性检测中，可以通过目视或比色法来判断结果，采用阳性判定值法或样本/阴性对照比值法。对于定量检测，可以依据标准曲线法，通过吸光值确定样本中待测物质的浓度。

尊龙凯时的ELISA技术因其操作简便、灵敏度高和特异性强，而在生物医学研究及临床诊断中占据不可或缺的位置。掌握其原理和操作要点可以有效提升检测的准确性与可靠性。

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